細(xì)胞系在生物科學(xué)中被廣泛使用，它們無限增殖的能力意味著，從理論上講，科學(xué)家們可以精確地復(fù)制以前的研究重現(xiàn)實驗結(jié)果或者在此結(jié)果基礎(chǔ)上做更深入的研究。但是細(xì)胞系被貼錯標(biāo)簽或處理不當(dāng)會導(dǎo)致有問題的細(xì)胞系的錯誤識別，污染和/或傳播，進(jìn)而可能影響研究數(shù)據(jù)的有效性和準(zhǔn)確性。
科學(xué)研究中所用細(xì)胞系的真實性驗證是基礎(chǔ)而且必要的。真實性驗證能夠確保細(xì)胞沒有鑒定錯誤、沒有交叉污染、遺傳上與起始保存樣品沒有差異。那在科學(xué)研究工作中應(yīng)該如何選擇所需要的細(xì)胞？如何獲取實驗所需細(xì)胞？所選用的或得到的細(xì)胞可靠性如何？如何判斷？這些問題對于需要使用細(xì)胞進(jìn)行研究工作的科研人員是必須首先解決的問題。希望大家能在接下來的內(nèi)容中找到答案。
一、細(xì)胞來源
細(xì)胞系可以 1) 直接從各種正常組織直接取材，進(jìn)行原代培養(yǎng)，2) 可以從其他實驗室獲得，3) 也可以從細(xì)胞庫購買。無論采用何種來源，都必須確保對細(xì)胞進(jìn)行身份驗證，并且沒有污染，例如支原體。那不同來源的細(xì)胞需要注意哪些問題呢？
1、直接取材，進(jìn)行原代培養(yǎng)獲得
從新鮮組織中衍生出一種新的細(xì)胞系，特別是人類細(xì)胞，是一項昂貴且費時的工作。新細(xì)胞系的后續(xù)價值將取決于驗證其來源的能力以及相關(guān)的可用信息。這些信息包括細(xì)胞來源組織，臨床資料，其他相關(guān)信息。
（1）細(xì)胞來源組織：首先需要獲得捐助者或患者的同意和/或道德審查許可。另外，要記錄組織來源，進(jìn)行組織病理學(xué)驗證，與正常組織進(jìn)行比較。
（a）將用于原代培養(yǎng)的一小部分樣品（或血液樣品或來自供體的 DNA）立即冷凍或處理。然后可以使用組織或 DNA 明確證明該細(xì)胞系源自推定的供體。盡管基因型（核型，拷貝數(shù)變異（CNV）作圖分析，甚至全基因組序列）的其他信息有時會有助于確保身份，但建議采用短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）進(jìn)行身份驗證。
（b）理想的情況是，用于組織病理學(xué)驗證的組織最好由同一組織病理學(xué)家報告手術(shù)標(biāo)本。如果患者樣本由臨床醫(yī)生直接提供給實驗室，則此步驟特別重要，因為它可能無法代表發(fā)送給組織病理學(xué)家的手術(shù)樣本。例如，它可能距腫瘤一定距離并因此缺乏癌細(xì)胞，或者可能來自不受遺傳或表觀遺傳缺陷引起的特定病理學(xué)影響的區(qū)域。
（c）少量血液（例如 10 毫升）或正常組織應(yīng)冷凍。該組織以后可用于尋找遺傳差異，也可用于身份驗證。對于 iPSC 品系，或當(dāng)使用直接重編程從一種衍生出另一種體細(xì)胞類型時，冷凍保存所用原始細(xì)胞的儲備液也是一種好習(xí)慣。這些對于使用新的重編程技術(shù)衍生出其他細(xì)胞系可能很重要，而且對于提供原始供體材料以驗證使用該細(xì)胞系的后來發(fā)現(xiàn)也可能很重要。如果使用體細(xì)胞核移植（SCNT）或「克隆」技術(shù)來衍生細(xì)胞系，例如 ES 細(xì)胞，則應(yīng)分別保留來自體細(xì)胞供體和卵母細(xì)胞供體的細(xì)胞或組織，以匹配核和線粒體 DNA。
（2）臨床資料：如果捐贈者或患者表示同意并經(jīng)過道德審查，則應(yīng)盡可能多地記錄和存儲以下盡可能多的信息。用于明確識別捐贈者的信息（包括姓名，醫(yī)院編號，地址和出生日期）應(yīng)以更高的安全性存儲，最好與其他數(shù)據(jù)分開存儲。在英國，需要 NHS 合同或名譽合同來獲得患者詳細(xì)信息，并且此類信息切勿與未經(jīng)授權(quán)的同事共享或發(fā)布到公共領(lǐng)域。
（a）供體/患者的年齡和性別
（b）醫(yī)院和病理編號
（c）組織標(biāo)本的起源部位和性質(zhì)
（d）癌癥或其他綜合癥或病理的階段和等級
（e）組織病理學(xué)報告的副本
（f）臨床病史包括治療
（g）其他信息，例如腫瘤標(biāo)記物狀態(tài)，遺傳信息和家庭數(shù)據(jù)等
（h）捐助者的知情同意和放棄商業(yè)權(quán)利的證據(jù)
（3）其他相關(guān)信息：關(guān)于該細(xì)胞系的起源和派生保留的信息越多，該細(xì)胞系對始發(fā)者和任何后續(xù)用戶有用的可能性就越大。這些信息包括：所有培養(yǎng)基和添加劑的類型，來源和批號以及建立細(xì)胞系的方法；使用抗生素情況，支原體檢測情況；細(xì)胞系是否經(jīng)過基因修飾；對于 iPSC 或通過直接重編程衍生的細(xì)胞系，應(yīng)描述所用方法，包括所用基因和載體等等。
2、從其他實驗室獲得
從其他實驗獲得細(xì)胞這種途徑存在許多潛在的危害。細(xì)胞系可能根本不是他們聲稱的那樣，并且不能保證它仍然是同一細(xì)胞系或具有與已發(fā)布描述的相同屬性。如果接收實驗室希望依靠通過細(xì)胞系獲得的歷史數(shù)據(jù)，則在接受進(jìn)入的細(xì)胞系用于一般用途之前，應(yīng)進(jìn)行驗證。
在收到細(xì)胞細(xì)后，同時在在凍存之前，應(yīng)使用已經(jīng)批準(zhǔn)的基于 DNA 的方法進(jìn)行細(xì)胞系鑒定，以確認(rèn)細(xì)胞系的起源并檢查錯誤識別。對照國際細(xì)胞系認(rèn)證委員會（ICLAC）錯誤識別的細(xì)胞系數(shù)據(jù)庫來檢查細(xì)胞系名稱。在將新的細(xì)胞系存入液氮時應(yīng)重新用 STR 對細(xì)胞身份進(jìn)行驗證。人類細(xì)胞系可能攜帶病原體，包括病毒污染，對實驗室工作人員構(gòu)成潛在的健康危害。它們還可能被細(xì)菌，真菌，支原體或病毒污染，并可能擴散到其他細(xì)胞系。如果要將這些細(xì)胞用于動物，必須對它們進(jìn)行測試并證明不含相關(guān)病原體，這一點也很重要。否則這些病原體可能會對動物或者照顧動物的科研人員帶來危害。
新細(xì)胞系應(yīng)在實驗室和儲存中進(jìn)行隔離，直到對它們的來源進(jìn)行鑒定，并證明它們不含微生物。最佳方法是擁有 II 級微生物安全柜（MSC）和專用于隔離區(qū)的培養(yǎng)箱。如果無法做到這一點，則應(yīng)采取其他步驟以zui大程度地減少污染擴散的風(fēng)險，其中包括（a）僅當(dāng)當(dāng)天所有其他細(xì)胞培養(yǎng)完成后才對新細(xì)胞系進(jìn)行處理，（b）在進(jìn)入普通培養(yǎng)箱之前，應(yīng)應(yīng)將新的培養(yǎng)物放置在專用培養(yǎng)箱中或密封容器中；（c）使用后，應(yīng)使用合適的非腐蝕性消毒劑清潔 MSC，并在關(guān)閉前再運行至少 5 分鐘。
用戶還應(yīng)確認(rèn)他們獲得的細(xì)胞系適合于他們自己的特定目的。即使顯示出細(xì)胞系是真實的，它也可能會隨著傳代時間的延長而失去特定的關(guān)鍵特征。 核型分析是一種簡單的測試，可以揭示細(xì)胞系的變化。在開始工作之前確認(rèn)適當(dāng)?shù)奶匦钥梢怨?jié)省大量的時間和精力。
3、從細(xì)胞庫購買
學(xué)術(shù)機構(gòu)或商業(yè)機構(gòu)已經(jīng)建立了許多保藏中心或細(xì)胞庫。這些來源的細(xì)胞系已經(jīng)進(jìn)行了驗證，并鑒定其在培養(yǎng)物中常見的污染微生物，因此除非隨附信息中另有說明，否則它們不太可能被污染或錯誤識別。但是，其中一些細(xì)胞系是在實驗室之間多次轉(zhuǎn)移后獲得的，因此，除非在分析證書中明確說明，否則不能保證真實性和不受微生物污染的影響。這些保藏中心或者細(xì)胞庫會對其細(xì)胞系進(jìn)行常規(guī)驗證，并為細(xì)胞系提供分析證書，包括 STR 分型報告。
二、細(xì)胞儲存
一旦細(xì)胞系已經(jīng)開發(fā)或獲得并驗證（即顯示為真實且未受污染），確?？煽壳铱芍噩F(xiàn)的細(xì)胞供應(yīng)的第一步是冷凍保存約 20 個 1 ml 安瓿瓶，每個安瓿瓶中裝有 1~5*10^6 個細(xì)胞。這將為絕大多數(shù)實驗室提供多年的現(xiàn)成貨源。通常是在防腐劑（通常是含有 10％DMSO 的生長培養(yǎng)基）中緩慢（通常 1 ℃ min-1）冷凍樣品來保存細(xì)胞系。某些細(xì)胞類型，例如 hESC，可能需要超速冷凍或玻璃化，其中水被原位冷凍形成玻璃，并且不允許像慢速冷凍一樣從細(xì)胞中滲透出來，通常用于冷凍干細(xì)胞。每次冷凍一批細(xì)胞時，建議立即復(fù)蘇一個小瓶以檢查其生存能力。從庫中取出的小瓶應(yīng)快速融化（通過浸入 37°C 的水浴中），并用預(yù)熱的培養(yǎng)基逐漸稀釋細(xì)胞懸液。必須將可能具有傳染性的材料存儲在氣相液氮中，以減少污染性生物轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。安全起見，重要的物料（例如 MCB）可以分開儲存到一個以上的儲存容器中，最好在放置到不同的位置，做好使用的登記記錄。細(xì)胞的位置應(yīng)在電子表格或數(shù)據(jù)庫中詳細(xì)說明，并與細(xì)胞系的起源和特征以及已應(yīng)用的質(zhì)量控制措施的詳細(xì)信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)。冷凍儲藏容器應(yīng)裝有警報器，并定期檢查儲存溫度。建議每周至少一次記錄儲存容器中液氮的水平。對定期維護(hù)，監(jiān)視和庫存控制的證據(jù)進(jìn)行定期審核還將有助于確保存儲設(shè)施的安全性。
三、細(xì)胞錯誤識別
錯誤識別是由于交叉污染，控制不當(dāng)或文書錯誤造成的，并暗示了良好的細(xì)胞培養(yǎng)方法（GCCP）的失??；例如，將細(xì)胞意外轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基的儲液瓶中，該儲液瓶在 MSC 中同時具有兩個細(xì)胞系，貼錯了燒瓶或安瓿的標(biāo)簽，或解凍了錯誤的安瓿。交叉污染的其他來源是飼養(yǎng)細(xì)胞（例如，在 ES 細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)常使用的）由于輻照或 siliemeisuC 處理不充分仍具有有絲分裂活性，或者是制備的條件培養(yǎng)基且未進(jìn)行充分過濾以除去細(xì)胞。每當(dāng)在實驗室中維持快速生長的連續(xù)細(xì)胞系時，就有可能交叉污染（即替換）其他生長較慢的細(xì)胞系的風(fēng)險。我們可以從 ICLAC（ICLAC，2013a）獲得已知的錯誤識別的細(xì)胞系列表。但是，即使某個細(xì)胞系不在該列表中，實驗室也應(yīng)始終進(jìn)行測試以確保其自身的該細(xì)胞系庫存是真實的。因此，必須采取簡單的預(yù)防措施以zui大程度地減少細(xì)胞錯誤識別的可能性，這些措施包括：
（1）所有培養(yǎng)容器以及存儲容器都必須小心且正確地貼上標(biāo)簽（包括細(xì)胞系的全名，傳代號和轉(zhuǎn)移日期）；
（2）生物安全柜一次只能使用一個細(xì)胞系。 取出細(xì)胞后，應(yīng)在安全柜中用適當(dāng)?shù)囊后w消毒劑擦拭并運行至少 5 分鐘，然后再引入另一個細(xì)胞系；
（3）瓶或等分試樣只能用于一個細(xì)胞系；
（4）氣溶膠的形成必須控制在最小程度；
（5）應(yīng)定期返還冷凍存量（除非必要，否則切勿細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng) 43 個月或 10 代）
四、細(xì)胞的真實性驗證
不管原代培養(yǎng)還是引進(jìn)，細(xì)胞使用時仍需進(jìn)行適當(dāng)鑒定。培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定主要有 6 個方面的要求：
1 證實其來源的物種
通過細(xì)胞遺傳學(xué)進(jìn)行染色體檢測，進(jìn)行細(xì)胞同工酶種類的檢測，一方面確認(rèn)其起源物質(zhì)，另一方面排除與其他種屬來源細(xì)胞的交叉污染。
2 與來源組織的關(guān)系
通過免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR、Western Blot 等方法，檢測細(xì)胞中特定分子的表達(dá)，確定細(xì)胞所在組織中的細(xì)胞類型；確定細(xì)胞所處的分化發(fā)育過程中的位置（例如, 干細(xì)胞階段、前體細(xì)胞階段或分化階段）。
3 確定細(xì)胞系是否轉(zhuǎn)化
通過體內(nèi)移植，成瘤性觀察實驗，明確該細(xì)胞系是有限細(xì)胞系還是連續(xù)細(xì)胞系；細(xì)胞系是否表達(dá)惡性特征。
4 確定無細(xì)胞系交叉污染
通過細(xì)胞 DNA 分型（指紋、SSP、STR、SNP）分析，與細(xì)胞培養(yǎng)初代和同一來源組織、血液細(xì)胞 DNA 型進(jìn)行比較，確認(rèn)細(xì)胞系無交叉污染。也可通過同工酶檢測及細(xì)胞遺傳學(xué)檢測。
5 是否有跡象表明細(xì)胞系有遺傳不穩(wěn)定的傾向性，易于轉(zhuǎn)化和表型的多樣性
通過染色體分析或 FISH 等檢測進(jìn)行觀察和證明。
6 特定細(xì)胞系需要特征的證明
一組起源相同的細(xì)胞中的特定細(xì)胞系，挑選出的細(xì)胞株或雜交細(xì)胞系，需要提供該細(xì)胞系或細(xì)胞株特征的證明，如分子標(biāo)記特征。
具體到每株細(xì)胞系，并不是所有的指標(biāo)都進(jìn)行實驗驗證。STR 分型分析是鑒定細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)方法。美國標(biāo)準(zhǔn)（ASN-0002 2011）提供了有關(guān)如何使用 STR 分析進(jìn)行人類細(xì)胞系認(rèn)證的信息。應(yīng)遵循該標(biāo)準(zhǔn)的建議，包括使用至少八個核心 STR 基因座和應(yīng)用匹配標(biāo)準(zhǔn)（匹配閾值 80％），以允許某些細(xì)胞系中發(fā)生少量遺傳漂移。
五、支原體污染
1950 年代shou次注意到細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染，但令人遺憾的是仍然經(jīng)常忽略它的存在。我們要清楚的知道如下幾點，對于我們在平常實驗中重視支原體污染問題非常重要。
（1）在世界范圍內(nèi)，支原體污染非常頻繁。
（2）使用有支原體污染的細(xì)胞會導(dǎo)致錯誤，誤導(dǎo)或錯誤的實驗結(jié)果。
（3）由于缺乏明顯的體征，支原體陽性細(xì)胞培養(yǎng)可能不被注意。
（4）注意支原體污染的潛在來源
（5）使用良好的無菌技術(shù)和實驗室操作規(guī)程，避免支原體污染。
（6）對所有未經(jīng)測試的細(xì)胞系采取有效的隔離程序。
（7）建立定期和連續(xù)的支原體檢測程序。
（8）科學(xué)期刊開始接受支原體檢測的證據(jù)，然后再接受論文發(fā)表。
支原體污染對宿主真核細(xì)胞的影響程度變化很大，但已顯示出它可以改變許多宿主細(xì)胞的功能，包括生長，形態(tài)，代謝，基因組和抗原性。因此，在實驗中使用被支原體污染的培養(yǎng)物將引來對所產(chǎn)生的任何研究數(shù)據(jù)的有效性和重要性的明顯質(zhì)疑，并可能導(dǎo)致發(fā)表錯誤的實驗結(jié)果?，F(xiàn)在越來越多的期刊在接受論文發(fā)表前要求提供證據(jù)證明研究中已使用細(xì)胞培養(yǎng)物不存在支原體的污染。
六、總結(jié)
1、啟動新的細(xì)胞系時，請記錄與組織起源有關(guān)的所有數(shù)據(jù)，并保留組織用于 DNA 分析。
2、確保新細(xì)胞系的名稱是唯yi的。
3、獲得的細(xì)胞系應(yīng)來自可靠的來源，并且必須經(jīng)過身份驗證以避免錯誤識別。
4、應(yīng)當(dāng)將經(jīng)過身份驗證的細(xì)胞保存起來，以備將來使用，并定期從冷凍庫中更換培養(yǎng)物。
5、獲取細(xì)胞系組織有道德和法律上的要求。使用人體組織樣品通常需要患者同意，并且必須定義所有權(quán)。
6、將人體組織樣本作為可能具有傳染性的材料處理。
7、在開始實驗之前，為所有類型的實驗室廢物建立正確的處置途徑，確保工作人員接受適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)。
8、從信譽良好的來源購買培養(yǎng)基和試劑（尤其是血清）。
9、記錄實驗所用的所有試劑和介質(zhì)的批號。
10、建立「標(biāo)準(zhǔn)操作程序」（SOP）。良好的細(xì)胞操作規(guī)范可以很大程度上避免其他污染。
11、確保實驗室設(shè)備的所有物品（柜，培養(yǎng)箱，高壓滅菌器，水過濾裝置等）均得到適當(dāng)維修，并在規(guī)定的范圍內(nèi)工作。
12、錯誤識別仍然是一個主要問題，因此所有細(xì)胞系均應(yīng)從可靠來源獲得并證明是真實的。
13、支原體的污染仍然很普遍，需要良好的組織培養(yǎng)實踐和頻繁的測試以確保細(xì)胞系清除污染。
迄今為止，只有少數(shù)的研究實驗室和科學(xué)期刊采取措施來改變繼續(xù)使用錯誤標(biāo)識的細(xì)胞系的可怕局面，承擔(dān)著發(fā)布高質(zhì)量受控數(shù)據(jù)的責(zé)任。毋庸置疑，期刊和科學(xué)協(xié)會的企業(yè)將極大地促進(jìn)此類質(zhì)量控制措施并加速其廣泛接受。讓我們大家共同努力，從你我做起，保證所發(fā)表的文章數(shù)據(jù)真實可信，可被重復(fù)。
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